本文構(gòu)建了液相色譜法同時檢測咖啡豆中6種主要的酚酸類化合物:咖啡酸(caffeicacid)、3-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquin-icacid，3-CQA)、4-咖 啡 酰 奎 尼 酸(4-O-caf-feoylquinicacid，4-CQA)、5-咖 啡 酰 奎 尼 酸(5-O-caffeoylquinicacid，5-CQA)、3，5-二咖啡酰奎尼酸(3，5-O-dicaffeoylquinicacid，3，5-diCQA)、4，5-二咖啡酰奎 尼 酸(4，5-O-dicaffeoylquinicacid，4，5-diCQA) ，對我國咖啡豆原料及其制品的質(zhì)量控制、資源合理開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。
1實驗部分
1．1儀器、試劑與材料
液相色譜儀LCsolu-tion色譜數(shù)據(jù)工作站;梅特勒電 子 天 平(1/10000) ;超聲波清洗器;純 水 機。
5-CQA、咖啡酸對照品，3-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA對照品，4-CQA對照品，所有對照品純度均大于或等于98%;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純;水為超純水。咖啡豆樣品于2009年10月收集于云南麗江、德宏、保山、思茅4個產(chǎn)區(qū)各種植園(樣品粉碎過20目篩，室溫避光保存)。
1．2色譜條件
色譜柱:KromasilC18柱(200mm×4.6mm，5μm) ;柱 溫25°C;進 樣 量:10μL;流 動 相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)、乙腈(B)。洗脫程序:0～42min，5%B～25%B;43～46min，25%B;47～50min，25%B～50%B;51～52min，50%B;53～55min，50%B～5%B;56～60min，5%B。流速:1.0mL/min;檢測波長:325nm。
1．3對照品貯備液的制備
精密稱取咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diCQA對照品適量，分別置于25mL容量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到各對 照 品 貯 備 液。其質(zhì)量濃度依次為:103.20、337.68、208.15、447.90、166.67和206.15mg/L。再分別吸取咖啡酸0.01mL、3-CQA0.05mL、4-CQA0.05mL、5-CQA0.1mL、3，5-diCQA0.05mL、4，5-diCQA0.04mL充分混勻，得混合對照品貯備液，各組分相應(yīng)質(zhì)量濃度依次為:3.44mg/L、56.28mg/L、34.69mg/L、149.30mg/L、27.79mg/L和27.49mg/L。
1．4供試品溶液的制備
精密稱取0.25g咖啡豆碎末，置于100mL錐形燒瓶中，加入70%甲醇25mL，室溫下超聲提取30min，過濾冷卻定容于50mL容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，即為供試品溶液。
2結(jié)果與討論
2．1樣品前處理方法的優(yōu)化
2．1．1提取溶劑的考察
實驗分別比較了同等處理條件下，水、50%甲醇、70%甲醇對綠咖啡豆中酚酸類物質(zhì)的提取效果。結(jié)果顯示50%甲醇提取物中酚酸類物質(zhì)的含量為4.36%，明顯高于水提物的3.26%，而70%甲 醇 比50%甲醇提取物中酚酸類物質(zhì)的含量高0.20%。為了使樣品中的目標物盡可能地*提取出來，本實驗zui后選用70%甲醇作為提取溶劑。
2．1．2提取方法的考察
比較了同等處理條件下70%甲醇超聲法和回流法兩者的提取效果。經(jīng)測定，超聲法與回流法提取物中酚酸類化合物的含量分別為4.54%和4.21%，前者略高于后者且超聲提取法操作簡便、快速。此外，文獻報道綠原酸類化合物具有熱不穩(wěn)定性［2］，選擇在室溫下超聲提取更利于減少有效成分的損失。
2．1．3提取次數(shù)及時間的考察
比較了同等處理條件下70%甲醇超聲提取一次(30min)和超聲提取兩次(30min+15min)兩者的提取效果，結(jié)果表明超聲30min能夠*提取出咖啡豆中的酚酸類物質(zhì)。
2．2線性關(guān)系及檢出限
精密量取1.3節(jié)所述混合對照品貯備液，逐級稀釋配制成不同濃度的混合對照品工作液，分別進樣20μL，記 錄 峰 面 積。以 各 對 照 品 質(zhì) 量 濃 度(mg/L)X為橫坐標，其峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得到6種酚酸類物質(zhì)的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以儀器信噪比(S/N)確定6種化合物的zui低檢出限(LOD，S/N=3) ，見表1。
2．3精密度試驗
取1.3節(jié)所述混合對照品貯備液，在上述色譜條件下進樣10μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA、4，5-diC-QA峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.90%、0.85%、0.94%、0.81%、1.08%和0.83%。
2．4重復(fù)性試驗
精密稱取咖啡豆碎末(云南麗江)共6份，按1.4節(jié)方法制備供試液，在1.2節(jié)色譜條件下進樣10μL，測得咖啡酸的平均含量為0.46mg/L，RSD為0.75%;3-CQA的平均含量為11.14mg/L，RSD為1.51%;4-CQA的平均含量為15.72mg/L，RSD為1.80%;5-CQA的 平 均含 量 為139.18mg/L，RSD為2.08%;3，5-diCQA的 平 均 含 量 為13.96mg/L，RSD為1.29%;4，5-diCQA的 平 均 含 量 為13.79mg/L，RSD為1.45%。
2．5穩(wěn)定性試驗
取同一供試樣品提取液，在室溫中放置，分別在0、2、4、6、8、12h進樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積。咖啡酸、3-CQA、4-CQA、5-CQA、3，5-diCQA和4，5-diCQA峰 面 積的RSD分 別 為2.0%、1.6%、1.9%、1.2%、1.9%和2.2%。結(jié)果表明6種化合物溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。
2．6加樣回收率試驗
取0.25g已知6種酚酸含量的云南麗江咖啡豆樣品9份，分別加入混合對照品溶液(混合對照品溶液按1．3節(jié)所配制各對照品貯備液等量混勻制備，各組分質(zhì)量濃度為:3-CQA56.28mg/L、5-CQA74.65mg/L、4-CQA34.69mg/L、咖 啡 酸17.20mg/L、3，5-diCQA27.78mg/L、4，5-diCQA34.36mg/L)1、2、3mL，每組3份，按1.4節(jié)方法制備供試液進樣分析，計算各組分的加標回收率(見表2)。
2．7樣品含量測定
采用上述建立的分析方法，測定了云南德宏、思茅、保山及麗江4個產(chǎn)地的綠咖啡豆中6種酚酸類化合物的含量(見表3)。樣品檢測前均置于烘箱中同等溫度、時間(60°C，1h)烘干處理，以保證各樣品中水分含量基本一致。6種酚酸類化合物混合標準溶液和咖啡豆樣品的色譜圖見圖2。樣品檢測情況顯示，不同產(chǎn)地的咖啡豆中6種酚酸類化合物的含量差異明顯，其主要原因可能是由于原料品種、產(chǎn)地土壤栽培及氣候條件的不同，同時，也與原料采收時期及采后加工工藝有著密切關(guān)系。另外，云南4個產(chǎn)區(qū)的樣品中3-CQA、4-CQA、5-CQA的含量普遍偏高，保山咖啡豆中的5-CQA的含量尤為顯著，這為深入開發(fā)云南咖啡豆資源，尤其是保山潞江壩產(chǎn)區(qū)原料提供了重要參考。
3結(jié)論
綠原酸類化合物的分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多個酚羥基，其水溶液在中性和堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差，本實驗選用0.1%甲酸和乙腈作為流動相，抑制羧基和酚羥基電離，并針對咖啡豆中主要的酚酸類化合物特性對梯度洗脫程序作了相應(yīng)的調(diào)整，建立了同時測定咖啡豆中6種酚酸類化合物的液相色譜方法。該法簡便、快速、靈敏度高，適用于咖啡豆中6種酚酸類化合物的同時分析以及咖啡豆原料與制品的質(zhì)量控制和綜合評價。在本文研究基礎(chǔ)上，就如何有效提高綠咖啡豆中酚酸類化合物等多種營養(yǎng)物質(zhì)的含量及生物利用度，促進我國咖啡豆資源的深度綜合開發(fā)，加強產(chǎn)品在世界范圍的競爭力，本課題組將進行更為系統(tǒng)的植物資源與化學(xué)研究。
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